原位杂交第三天
1） 用1ml含10％热灭清的MABT溶液置换溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，湖北原位杂交，一小时以上，植物原位杂交，后用1mlMABT溶液置换，25分钟。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，染色体原位杂交，室温下显色。
4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色
5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
植物原位杂交的应用包括：
研究基因表达：通过观察荧光信号的位置和数量，可以确定目标基因在植物组织中的表达模式和位置。
染色体定位：将目标基因与染色体中的特定位置进行比较，可以确定目标基因在染色体中的位置和分布。
基因：通过原位杂交技术，可以确定目标基因的序列和位置，为基因提供重要的参考信息。
检测物种或品种特异性：通过原位杂交技术可以检测出不同物种或品种之间基因表达的差异，染色体荧光原位杂交，从而为物种或品种特异性研究提供依据。
遗传育种：通过原位杂交技术可以检测出不同品种之间基因表达的差异，从而为遗传育种提供重要的参考信息。
DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比，DNA探针与靶mRNA 分子的杂交强度较弱，因此在杂交后的洗涤中不应使用甲醛。
探针特异性至关重要。如果已知细胞中mRNA或DNA的确切核苷酸序列，则可据此设计高度的互补探针。如果超过 5% 的碱基对不互补，那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着，探针更容易在洗涤和检测步骤中被洗去，可能无法正确检测。
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